实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团（探针或染料），利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应过程，最后通过Cq或Ct值和标准曲线对起始模板进行绝对定量或相对定量分析。而评估荧光定量PCR反应效果好坏，可以从以下几个方面来评估：
1.扩增效率及相关系数
良好的PCR扩增是指数级的，理论上以100%的效率进行，但实际上并不是所有的PCR反应都表现出相同的高效率，所以需要验证实际的扩增效率E。当计算评估PCR扩增效率时，至少需要做3次平行重复，并至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度，得到线性方程Cq= -klgX0+b、扩增效率E=10(-1/k)-1。并且E在0.9-1.1之间，即扩增效率在90-110%，被认为此扩增接近理想情况；相关系数R2值大于0.98时，说明两个数值之间相关的可信度很好，可用来计算。
▲ 图1. 5个梯度稀释液的扩增曲线及标准曲线。
图源：Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统
2.精确度（Precision）
指多个复孔Cq值之间的接近程度，且重复孔之间的标准偏差不大于0.2，说明实验的重复性较好。
▲ 图2. 96孔重复的扩增曲线，Cq Mean=19.1，CV=0.002
图源：Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统
3. 重现性（Reproducibility）
指不同批次之间或不同实验室之间的结果变化，通常通过SD或者CV来评估。
▲ 图3. 4台独立的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统同时检测GAPDH，Cq Mean=20.11，SD= 0.002
4. 灵敏度（Sensitivity）
通常灵敏度表示为检测限(limit of detection, LOD)，可通过梯度稀释样品来确定最低检测限。分析灵敏度是指一个样本可通过实验精确测量的最小拷贝数。
5. 准确度（Accuracy）
指测量值与真实值的接近程度。针对低拷贝样本，由于受采样概率的影响，可能会导致结果不准确。为了更可靠地检测低拷贝，可以增大平行实验的重复数，来统计显著性。
▲ 图4. 低拷贝样本采样概率符合泊松分布
图源：网络，侵删
6. 特异性（Specificity）
指qPCR实验中只可以检测到目的基因，引物特异性扩增靶序列，而不会扩增其他基因序列。可通过凝胶电泳检测扩增产物是否为单一条带，或通过qPCR反应，根据溶解曲线是否具有单峰来判断。
▲ 图5. 溶解曲线单峰
图源：Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统
通过这六个方面就可以评估实时荧光定量PCR反应效果。你学会了吗？实验数据是好是坏快来自检吧。
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